La cloroquina 128

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Oncología Cartas cloroquina tiene tumorinhibitory y efectos tumorpromoting en triplenegative Autores de cáncer de mama: Johanna Tuomela Jouko H. Sandholm Joonas Kauppila Petri Lehenkari Kevin W. Harris KATRI S. Selander Afiliaciones: Departamento de Medicina de la Universidad de Alabama en Birmingham, Birmingham, AL 35294, EE. UU. , Departamento de Anatomía y Biología celular de la Universidad de Oulu, Oulu 90014, Finlandia Publicado en línea el: Viernes, 4 de octubre de 2013 Páginas: 1665-1672 doi: 10.3892 / ol.2013.1602 en este artículo se menciona en: Resumen Tolllike receptor9 (TLR9) es un receptor de ADN intracelular que se expresa ampliamente en la mama y otros cánceres. Hemos demostrado anteriormente que la expresión tumoral baja TLR9 el momento del diagnóstico se asocia con tiempos de supervivencia diseasespecific reducido significativamente en los pacientes con cáncer de mama triplenegative (forma de cáncer). No existen terapias dirigidas para este subgrupo de pacientes cuyo pronóstico es de las peores de cáncer de mama. Debido a los efectos in vitro previamente detectados en antiinvasive de cloroquina en estas líneas celulares, el presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos in vivo de la cloroquina contra dos subtipos clínicos de esta forma de cáncer que difieren en la expresión de TLR9. La cloroquina suprimió metaloproteinasas de matriz (MMP) 2 y actividad de la expresión de proteínas y MMP9 ARNm, mientras que la expresión de ARNm MMP13 y la actividad proteolítica se incrementaron. A pesar de la mejora de la expresión de mRNA TLR9, la cloroquina suprimió la expresión de proteína TLR9 in vitro. El tratamiento diario de ratones con intraperitoneal cloroquina (i. p.) (80 mg / kg / día) durante 22 días, no inhibió el crecimiento de células de cáncer de mama de control de siRNA o TLR9 siRNA MDAMB231. En conclusión, a pesar de la favorable en los efectos in vitro en forma de cáncer invasión y la viabilidad, especialmente en condiciones de hipoxia, la cloroquina no impide el crecimiento de las células MDAMB231 triplenegative con niveles altos o bajos de expresión de TLR9 en vivo. Esto puede explicarse por los efectos de activación de la cloroquina sobre la expresión de MMP13 o por el hecho de que la cloroquina, mediante la supresión de la expresión de TLR9, permite la activación de las vías moleculares actualmente desconocidos, que permiten el comportamiento agresivo de las células con la expresión TNBC TLR9 baja en la hipoxia. Introducción De todos los pacientes con cáncer de mama, aquellos con tumores triple negativo que carecen de la expresión del receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona y el receptor HER2, cargar con los pronósticos más pobres (1). Esto se debe al comportamiento agresivo de las células de cáncer de mama triple negativo (CMTN) y la falta de terapias dirigidas para este subgrupo particular. Esta forma de cáncer es, sin embargo, se requiere una enfermedad muy heterogénea e información más específica acerca de la biología de los diversos subtipos para futuras terapias dirigidas (1, 2). Toll-like receptor-9 (TLR9) es un receptor de ADN inmunidad innata que fue identificado primero en las células del sistema inmune (3). ligandos agonista TLR9, como el ADN microbiano y de vertebrados o que contienen CpG de secuencia de oligonucleótidos sintéticos, inducen una reacción inflamatoria en células que expresan TLR9. Además de inducir la liberación de citoquinas (4, 5) en las células cancerosas, los agonistas TLR9 también inducen la invasión in vitro. que está mediada a través de la activación de metaloproteinasas de la matriz (MMPs), tales como la MMP-13 (6 8). Hemos demostrado anteriormente que TLR9 tiene un papel importante en esta forma de cáncer (9) y demostró que, mientras que la expresión de TLR9 tumoral baja se asoció con la supervivencia específica del cáncer de mama reducido significativamente en los pacientes con esta forma de cáncer, TLR9 no tenía valor pronóstico en pacientes con cáncer de mama con tumores ER (9). Esto es probable que sea, al menos en parte, explicarse por el comportamiento de la hipoxia asociada de las células TNBC que expresan niveles bajos de TLR9. Hemos puesto de manifiesto que, a pesar de la disminución de la expresión de TLR9 en TNBC células da como resultado la invasión disminuido cuando las células tumorales están en normoxia, las células se vuelven altamente invasiva en hipoxia (9). Estos resultados sugieren que TLR9 también tiene efectos independiente de ligando sobre la invasión y que, en ausencia de la expresión de TLR9 en la hipoxia, otra vía es el mediador real de invasión. La vía que media la invasión en la hipoxia en ausencia de TLR9 no se conoce actualmente. Tampoco se sabe si la posible alteración de la inflamación mediada por TLR9-en el sitio del tumor contribuye a la mal pronóstico en este subgrupo de TNBC. Dado que las células CMTN hipoxia inducida por invasión in vitro y la viabilidad de que expresan niveles bajos de TLR9 se inhibió in vitro por cloroquina (9), un paludismo bien establecido y medicamento para la artritis reumatoide que se sabe que interfieren con la señalización endosoma, el presente estudio tuvo como objetivo para caracterizar aún más la eficacia antitumoral de la cloroquina contra las células TNBC con diferencias en la expresión TLR9. Materiales y métodos Cultivo de células parentales-231 MDA-MB células de cáncer de mama y D54MG, U373MG, las células Caco-2 y AGS se cultivaron en Dulbecco modificado Eagles medio (Gibco BRL, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.), complementado con un 10 por calor suero bovino fetal inactivado, L-glutamina, penicilina / estreptomicina y aminoácidos no esenciales (todos de Gibco BRL, Life Technologies) (10). Las células se cultivaron en incubadoras a 37ºC con una atmósfera de 5 CO2 / 95 aire con 21 pO2 o en una incubadora con 5 hipoxia pO2 (I-Guante BioSpherix, Ltd. Lacona, NY, EE. UU.). El ARNsi de control estable y células TLR9 siRNA MDA-MB-231 se han descrito anteriormente y se cultivaron en presencia de G418 (800 g / ml) (9). La cloroquina fue comprado a Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). el aislamiento de ARN y cuantitativa (q) PCR Se aisló ARN total de las células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se purificaron con kits RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). Todos los reactivos para los experimentos de qPCR se compraron de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.). cDNA fue sintetizado a partir de 0,2 g de ARN total, usando Multiscribe transcriptasa inversa y hexámeros aleatorios. Se realizó la cuantificación de la expresión de TLR9 ARNm como se ha descrito previamente (11). Los otros conjuntos de cebadores y sondas que se utilizaron (MMP-2, MMP-9, MMP-13 y TIMP-3) se adquirieron de Applied Biosystems conjuntos de cebador / sonda como tal a medida. Se utilizó un programa de amplificación estándar para todas las amplificaciones (1 ciclo de 50ºC durante 2 min, 1 ciclo de 95ºC durante 10 min, 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 min). Después de la normalización con la proteína ribosomal L15 niveles (RPLO) de expresión para cada cDNA, cuantificación relativa de ADNc diana se realizó usando 2 valores de Ct. El análisis de transferencia Western Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos con medio de cultivo normal hasta cerca de la confluencia, después de lo cual se lavaron con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y se cultivaron adicionalmente durante los tiempos indicados en medio de cultivo libre de suero. En los puntos de tiempo deseados, el medio de cultivo se desechó y las células se cosechan rápidamente en tampón de lisis (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EE. UU.) y se clarificó por centrifugación, como (8) descrito anteriormente. Después de hervir los sobrenadantes en la reducción de dodecil sulfato de sodio (SDS) tampón de muestra, cantidades iguales de proteína (100 g) se cargaron por carril y las muestras se sometieron a electroforesis en 10 o 420 geles de SDS poliacrilamida de gradiente (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules , CA, EE. UU.), después se transfirió a una membrana de nitrocelulosa. Para detectar TLR9, las transferencias se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos anti-TLR9 (IMG-431 IMGENEX, San Diego, CA, EE. UU.), diluido 1: 500 en solución salina tamponada con Tris con 0,1 (v / v) de Tween-20 ( TBST). La igualdad de carga se confirmó con policlonal de conejo anti-actina (Sigma A-2066, que se utiliza en 1: 1000 dilución). Secundaria detección se realizó con anticuerpos secundarios peroxidasa de rábano picante-linked (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.). Las bandas de proteínas se visualizaron por quimioluminiscencia utilizando un kit ECL (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, IL, EE. UU.). Ensayos de viabilidad celular Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (20.000 células por 100 l por pocillo) en medio de crecimiento normal. La viabilidad de las células se midió con el One Solution ensayo de proliferación celular CellTiter 96 acuoso (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En otro conjunto de experimentos, las células se sembraron en placas de 24 pocillos y después de la hora indicada, las células se tripsinizaron y se contaron las células viables después de la tinción con azul de tripano usando un contador de células automatizado TC10 (Bio-Rad Laboratories). Zymography se incubaron las células durante 2.448 h en medio libre de suero. Los sobrenadantes se recogieron y se concentraron usando un dispositivo de filtro centrífugo (Millipore, Billerica, MA, EE. UU. tamaño de corte de 3 kDa, gato no. UFC5-003-24). Cantidades iguales de proteína (20 g) se cargaron por carril de los geles de zimograma (10 gelatina, Bio-Rad Laboratories). Los geles fueron luego en Ejecutar, renaturated, desarrollaron y se tiñeron utilizando tampones zymogram Bio-Rad, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los estudios de control de animales y siRNA MDA-MB-231 células TLR9 (510 5 células en 100 l) se inocularon en las almohadillas de grasa mamaria de cuatro semanas de edad, los ratones inmunodeficientes (nude atímicos / nu Foxn1 Harlan Sprague Dawley, Inc. Indianapolis, IN, EE. UU.). Los tratamientos se iniciaron siete días después de la inoculación de células tumorales. Los ratones se trataron diariamente ya sea con intraperitoneal (i. p.) la cloroquina (80 mg / kg) o vehículo (PBS). Los animales se monitorizaron diariamente para detectar signos clínicos. medidas de los tumores se realizaron dos veces se calculó un volumen de tumor semanas y de acuerdo con la fórmula V (/ 6) (d 1 d 2) 3/2. donde d 1 y d 2 son diámetros tumorales perpendiculares (9). Los tumores se dejaron crecer durante 22 días, momento en el que los ratones fueron sacrificados y los tumores se fueron disecados para una medición final. A lo largo de los experimentos, los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos ambientales controladas (2021C, 3060 humedad relativa y un ciclo de luz de 12 h). Los ratones fueron alimentados con bolitas de comida para animales pequeños (Harlan Sprague Dawley) y se suministra con agua ad libitum estéril. Los procedimientos experimentales fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Cuidado de Animales y el empleo. Análisis estadístico Los resultados se presentan como la media ± SEM o media, como se indica. Estudiantes no apareados t-tests fueron utilizados para calcular las diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos de estudio en los estudios in vitro y preclínicos experimentos in vivo. Resultados Efectos de la cloroquina sobre la viabilidad celular de-MB-231 MDA células parentales ya que el comportamiento de las células TNBC se ve afectada significativamente por la hipoxia (9, 12), todos los experimentos se llevaron a cabo en normoxia (pO 2 21) y hipóxico (pO 2 5) las condiciones de cultivo. En primer lugar, se investigaron los efectos de la cloroquina sobre la viabilidad celular de las células parentales MDA-MB-231. De acuerdo con nuestras observaciones anteriores (9), las condiciones de cultivo hipóxicas indujo un aumento significativo en la viabilidad celular parental MDA-MB-231 en comparación con los cultivos que se mantuvieron en normoxia (9). La adición de 25 M cloroquina no afectar MDA-MB-231 viabilidad en normoxia, mientras que 50 M cloroquina tenía un efecto inhibidor leve pero significativo. Ni la dosis de cloroquina, sin embargo, bloqueó completamente el aumento de la hipoxia inducida en la viabilidad (Fig. 1A). También se realizaron estudios similares con células MDA-MB-231 que fueron transfectadas establemente con el control siRNA - o TLR9 siRNA-que codifican plásmidos. La cloroquina también inhibió el aumento inducido por hipoxia en la viabilidad en estas dos líneas celulares (Fig. 1B y C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que dosis-dependiente la cloroquina inhibe la viabilidad inducida por hipoxia de las células MDA-MB-231 y que estos efectos son independientes del estado de expresión de TLR9 de las células. Figura 1 (A) Parental MDA-MB-231, (B) MDA-MB-231 de control de siRNA y (c) MDA-MB-231 células TLR9 siRNA se cultivaron en normoxia (pO2 21) e hipóxicas (pO2 5) Condiciones de cultivo durante 24 h, después de lo cual la viabilidad celular se midió con MTS-ensayos. Los datos se expresan como la media SEM, n6. P MTS, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4sulfophenyl) 2H-tetrazolio, sal interna Efectos de la cloroquina sobre la expresión de TLR9 la hipoxia inducida por A continuación, los efectos de la cloroquina sobre la expresión de TLR9 inducida por hipoxia fueron estudiados. Como también detectado anteriormente, la hipoxia inducida por un aumento significativo en la expresión TLR9 mRNA en las células parentales MDA-MB-231 (Fig. 2A). Este efecto fue significativamente mayor de cloroquina en las condiciones de cultivo normoxic hipóxica. En la hipoxia, el efecto de la cloroquina fue, sin embargo, reduce significativamente (Fig. 2B). También se detectaron efectos similares sobre la expresión de mRNA TLR9 por cloroquina en las líneas celulares de cáncer D54MG y cerebrales U373MG (Fig. 2C y D). Por otra parte, una tendencia similar en la expresión de TLR9 mRNA también se detectó en las células Caco-2 y AGS colorrectal humano y líneas celulares de adenocarcinoma gástrico, respectivamente (Fig. 2E). A nivel de proteína, sin embargo, la cloroquina disminuyó MDA-MB-231 expresión de la proteína TLR9, en normoxia e hipoxia (Fig. 2F). También se detectaron efectos similares sobre la proteína TLR9 en el control de células siRNA y TLR9 siRNA (Fig. 3). En conjunto, estos estudios sugieren que la cloroquina tiene efectos opuestos sobre TLR9 ARNm y la expresión de proteínas. La Figura 2 de los padres células (A) MDA-MB-231 se cultivaron durante 24 h en condiciones de hipoxia y normoxia. La expresión de TLR9 mRNA se midió con qPCR media SEM, n6. P TLR9, Toll-like receptor-9. Figura 3 Análisis de transferencia Western de la proteína TLR9 en siRNA de control o células TLR9 siRNA MDA-MB-231 después del cultivo durante 24 h bajo normoxia (N) o hipoxia (H), en presencia de vehículo o 25 o 50 M cloroquina. banda de actina de la misma transferencia despojado se muestra para indicar la igualdad de carga. TLR9, Toll-like receptor-9. Efectos de la cloroquina sobre la MMP-2, MMP-9 y MMP-13 expresión de ARNm y la actividad proteolítica de las células TNBC con expresión alta y baja TLR9 TLR9 invasión inducida por el ligando se ha demostrado que se asocia con la activación de MMP-13 (6 8 ). Desde la cloroquina inhibe la invasión de TLR9-inducida por ligando en normoxia in vitro. los efectos de la cloroquina sobre la MMP-2, la expresión de MMP-9 y MMP-13 mRNA, así como la actividad proteolítica de células TNBC con expresión alta y baja TLR9 se investigaron. La cloroquina tuvo efectos similares, supresores sobre la MMP-2 expresión de ARNm en normoxia e hipoxia en todas las células estudiadas (Fig. 4A). Los efectos sobre la MMP-9 expresión de mRNA fueron más de la dosis y el oxígeno-dependiente de estado. Mientras que 25 M cloroquina suprimió MMP-9 expresión de ARNm en normoxia e hipoxia, la dosis 50-M fue menos supresora en normoxia y no suprimió MMP-9 expresión de ARNm en células parentales MDA-MB-231 en condiciones de hipoxia. Se observaron efectos similares en el control y TLR9 siRNA MDA-MB-231 células, con la excepción de que, en las células TLR9 siRNA en comparación con el vehículo de tratamiento, 50 M cloroquina indujo supresión significativa de la MMP-9 expresión de ARNm en normoxia e hipoxia ( la Fig. 4B). La cloroquina también tuvo un efecto dual, dependiente de la dosis en la expresión de mRNA de MMP-13. En normoxia e hipoxia, la dosis 25-M indujo ningún cambio o ligeramente suprimida MMP-13 expresión de ARNm en todas las células estudiadas. La concentración de cloroquina mayor (50 M), sin embargo, indujo un aumento significativo de la MMP-13 expresión de ARNm en normoxia en todas las células. Esta inducción de MMP-13 mRNA se mejoró aún más significativamente por la hipoxia en las células siRNA de control, pero disminuyó en las células TLR9 siRNA (Fig. 4C). También se detectaron los efectos de estado dependiente de la dosis y de oxígeno similares sobre MMP-13 expresión de ARNm en las líneas celulares de glioblastoma D54MG y U373MG humanos. La dosis más pequeña tenía ninguna o sólo un efecto ligeramente supresor sobre MMP-13 expresión de ARNm, mientras que la dosis más alta inducida MMP 13-mRNA de una manera dependiente del nivel de oxígeno (Fig. 4D). El AGS células Caco-2 y se estudiaron sólo en normoxia. En las células Caco-2, 50 M cloroquina no tuvo efecto sobre la MMP-9 mRNA, pero suprimió MMP 2-mRNA e indujo significativamente MMP-13 expresión de ARNm. Del mismo modo, 50 M cloroquina también indujo MMP-13 expresión de ARNm en las células AGS (Fig. 4E). Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que la cloroquina tiene efectos por células, la dosis y la hipoxia depende de MMP-2, MMP-9 y MMP-13 la expresión del ARNm. Más notablemente, dosis más altas de cloroquina parecen inducir más MMP-13 expresión de ARNm, suprimir menos MMP-9 expresión de ARNm y, en la hipoxia, estos efectos parecen ser TLR9-dependiente. Figura 4 Expresión de (A) MMP-2, (B) MMP-9 y (C) MMP-13 mRNA en células parentales MDA-MB-231, el control de las células siRNA o TLR9 siRNA en normoxia e hipoxia, tal como se mide con qPCR. Las barras representan cambios cloroquina inducida en la expresión de mRNA, con respecto al vehículo de tratamiento (línea de puntos) en normoxia e hipoxia significa SEM, n36. P TLR9, Toll-like receptor-9. Efectos de la cloroquina sobre MMP a nivel de proteína funcional Para investigar si los efectos chloroquines sobre MMP mRNAs se traducen al nivel de proteína funcional, se realizaron zimogramas utilizando los sobrenadantes de las células después de los diversos tratamientos. Después de 24 h de tratamiento, la MMP-2 pro-bandas proteolíticas pro-MMP-9 y fueron claramente visible (13), pero no se detectaron diferencias claras en las actividades proteolíticas entre los diversos tratamientos de las células estudiadas (Fig. 5A) . Sin embargo, después de 48 h, mientras que MMP-2 y MMP-9 actividades fueron suprimidos por la cloroquina, la MMP-13 actividad proteolítica comenzó a surgir en las mismas muestras (Fig. 5B). Los datos se muestran sólo para las células TLR9 siRNA en normoxia, aunque se detectaron resultados similares para todas las células estudiadas en normoxia e hipoxia. Figura 5 (A) zimogramas de sobrenadantes de vehículo, 25 o 50 M células MDA-MB-231 parentales cloroquina tratadas o las células de control siRNA o TLR9 siRNA después de 24 h de tratamiento en normoxia (N) o hipoxia (H). (B) Zimograma de sobrenadantes de vehículo, 25 o 50 M cloroquina tratados con células TLR9 siRNA MDA-MB-231 en normoxia. Las flechas apuntan a la 92 kDa pro-MMP-9 (flecha de puntos) y la de 72 kDa pro-MMP-2 (flecha negro). La banda de 40 kDa representa la MMP-13 (flecha roja). MMP, metaloproteinasas de matriz TLR9, Toll-like receptor-9 CQ, la cloroquina. la eficacia antitumoral de la cloroquina en un modelo de ratón ortotópico La eficacia antitumoral de la cloroquina se estudió en un modelo de ratón ortotópico, utilizando el control de siRNA y las células TLR9 siRNA MDA-MB-231. Después de la inoculación de células tumorales y el establecimiento de tumores siete días después, los ratones se trataron diariamente con inyecciones i. p. cloroquina (80 mg / kg). Como era de esperar, las células TLR9 siRNA formaron tumores significativamente más grandes que las células de control siRNA durante el experimento. El tratamiento con cloroquina no inhibió el crecimiento del tumor, ya sea en el ARNsi de control o grupos TLR9 siRNA (Fig. 6A y B). Tomados en conjunto, a pesar de los antitumorales y anti-invasivos efectos favorables que exhibe la cloroquina contra las células de cáncer de mama ensayadas in vitro. los resultados sugieren que la cloroquina no impide el crecimiento de estas células en el sitio ortotópico in vivo. Figura 6 (A) Crecimiento de tumores ortotópico formados por ARNsi de control o células TLR9 siRNA MDA-MB-231. Media ± SEM, n20. P0.05, tumores TLR9 siRNA tratados con vehículo frente a los tumores de control siRNA tratados con vehículo y tratados con cloroquina tumores TLR9 siRNA frente a los tumores de control siRNA cloroquina tratada. TLR9, Toll-like receptor-9. Discusión En la era actual de aumento de los costos de atención del cáncer, hay cada vez más interés en identificar nuevos usos para medicamentos antiguos (14, 15). Por ejemplo, la cloroquina ha demostrado efectos prometedores como un agente anti-cáncer, particularmente en cánceres de mama (16 de 19). La cloroquina ha sido demostrado que inhibe el crecimiento del cáncer de mama in vitro, y dosis bajas de cloroquina haber inducido resistencia a la carcinogénesis mamaria en un modelo de rata de los cánceres de mama inducidos químicamente (20, 21). Desde nuestra anterior los datos in vitro sugiere que la cloroquina inhibe la capacidad invasiva de las células CMTN con el fenotipo de baja expresión de TLR9 altamente agresiva (7, 8), el presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos antitumorales de este ampliamente utilizado, contra la malaria y drogas reumatología en un modelo de ratón que imita la enfermedad humana agresivo in vivo. De acuerdo con nuestros datos preliminares, tales pacientes con bajos pronósticos TLR9 CMTN y pobres pueden representar hasta el 10 de todos los pacientes con cáncer de mama (9). Los presentes resultados demostraron que, a pesar del crecimiento hipoxia asociada a efectos inhibitorios prometedores in vitro. cloroquina no inhibe el crecimiento local de los tumores formados por las mismas células in vivo. La razón de la discrepancia entre la in vitro e in vivo los resultados es claro en la actualidad y requiere una caracterización adicional. el crecimiento del tumor local es la suma de la proliferación celular y la invasión local. Así, la falta de inhibición del crecimiento del tumor puede, al menos en parte, se explica por los efectos pro-invasivos de cloroquina, tales como el aumento de la actividad de MMP-13, que a nivel de proteínas se manifiesta más tarde que los efectos anti-invasivos y de inhibición del crecimiento y que puede ser más pronunciado en condiciones de hipoxia. Los presentes resultados son lo contrario de los publicados por Jiang et al (22), quienes observaron que la cloroquina inhibe el crecimiento de las subcutáneas (s. c.) 4T1 tumores de mama y metástasis pulmonares in vivo. La cloroquina, solo o en combinación con el inhibidor de mTOR RAD001, también se ha demostrado que inhibe el crecimiento in vivo de tumores MCF-7 ortotópico (21). Las diferencias en los resultados pueden explicarse por las diferentes líneas celulares usadas y la dosis del fármaco es posible que, por ejemplo, los efectos MMP-13-activación de cloroquina se manifiestan sólo con las dosis de cloroquina superiores, similares a las utilizadas en nuestros estudios . A parte de las diferencias en las respuestas a la cloroquina también puede explicarse por el estado de p53 de las líneas celulares utilizadas. La cloroquina se sabe que inducen la detención del ciclo celular a través de la activación del supresor tumoral p53, que está mutado en MDA-MB-231 células (20). Los presentes resultados, que mostró que la cloroquina inhibe el aumento de la viabilidad hipoxia inducida de estas células, sugieren que en la hipoxia, la cloroquina puede inducir otras vías de la muerte celular o detención del crecimiento, independientes de p53. Esto es apoyado por el hecho de que las células 4T1 se han mostrado ser p53 null (23). TLR9 es un receptor de ADN celular que, en base a nuestras observaciones, parece regular la invasión de células de cáncer en ausencia de ligandos de ADN añadido exógenamente. La cloroquina ha sido demostrado que inhibe TLR9 reacciones inflamatorias inducida por ligando en células y este efecto se ha atribuido a la inhibición de la acidificación endosomal y, más recientemente, para la unión directa de la cloroquina a los ácidos nucleicos, enmascarando así sus epítopos de unión a TLR9-(24). En particular, el presente estudio reveló que el tratamiento con cloroquina regula al alza la expresión de TLR9 ARNm en las células cancerosas. Este efecto sobre el ARNm se redujo ligeramente en la hipoxia, pero no se tradujo en un aumento de los niveles de proteína TLR9, incluso en condiciones repletas de oxígeno. Por el contrario, el tratamiento con cloroquina de hecho dio como resultado una disminución de la expresión de la proteína TLR9. Los presentes resultados concuerdan con los de Zhu et al (25) que demostró que la cloroquina inhibe la expresión de TLR9 en células dendríticas. La razón para estos resultados no está clara, pero puede ser que se requiere un pH bajo para el correcto plegamiento de la proteína TLR9 o la participación de microRNAs específicos que inhibirían la expresión de TLR9. Mediante el bloqueo de la acidificación de los orgánulos endosomal donde reside TLR9, la cloroquina puede también realmente acelerar la degradación de la proteína TLR9. Aunque Kuznik et al (24) demostraron que la cloroquina no aumenta el pH de los endosomas, la concentración de cloroquina estos autores utilizaron fue significativamente menor en comparación con los presentes experimentos (4 vs. 2,550 M). Estos temas requieren una mayor caracterización bioquímica a nivel celular. Otra posible explicación de por qué la cloroquina no impide el crecimiento del tumor en este modelo es que la reducción de la expresión de TLR9 puede promover la altamente agresivo fenotipo baja expresión TLR9 de las células TNBC (9), permitiendo así la activación de la vía actualmente desconocido de crecimiento agresivo y la invasión . En conclusión, a pesar de la prometedora TLR9 estado independiente del inhibidor del crecimiento y anti-invasivo en efectos in vitro contra las células TNBC en normoxia e hipoxia, la cloroquina no inhibe el crecimiento de tumores TNBC ortotópico in vivo. Además, mediante la promoción de la activación de MMP-13 y la supresión de la expresión de TLR9 en tales condiciones, la cloroquina puede ser una elección particularmente pobre para los tumores que son hipóxicas. La cloroquina puede, sin embargo, tienen inhibidora del crecimiento y los efectos anti-metastásicos contra otros tipos de cáncer de mama u otros cánceres. Este estudio fue financiado por subvenciones del Departamento de Defensa (W81XWH-10-1-0308, KSS), Laponia Cultural Foundation (KSS), Elsa U. Pardee Fundación (KSS), Fundación Maud Kuistila Memorial (JT), Finlandés Cultural Fundación (JS), Emil Aaltonen Fundación (JHK), Fundación de cáncer del Norte de Ostrobotnia (JHK), Oulu University Research Foundation (JHK), Georg C. y Fundación Ehrnroot María (JHK), Orion-Farmos Fundación de Investigación (JHK) y la Fundación médica de Finlandia (JHK). Christine Pressey es reconocido por la prestación de asistencia con los ensayos de qPCR. Referencias Tuomela, J. Sandholm, J. Kauppila, J. H. Lehenkari, P. Harris, K. W. Selander, K. S. (2013). La cloroquina tiene efectos tumorinhibitory y tumorpromoting en cáncer de mama triplenegative. Oncología Letters, 6, 1665-1672. http://dx. doi. org/10.3892/ol.2013.1602 Tuomela, J. Sandholm, J. Kauppila, J. H. Lehenkari, P. Harris, K. W. Selander, K. S .. Oncología Cartas 6.6 (2013): 1665-1672. Tuomela, J. Sandholm, J. Kauppila, J. H. Lehenkari, P. Harris, K. W. Selander, K. S .. Oncología de las letras 6, no. 6 (2013): 1665-1672. http://dx. doi. org/10.3892/ol.2013.1602